Prelucrarea statistică a datelor 

Prima etapă în analiza datelor va fi aplicarea testului Shapiro-Wilk prin care se va verifica distribuția acestora. Testul unidirecțional ANOVA urmat de testul Tukey HSD va fi efectuat pentru a demonstra diferențele semnificative ale variației comportamentului investigat comparat cu datele din pretratament. În cazul stresului oxidativ va fi calculată variația dintre grupul control și grupurile experimentale. 

 

Teste comportamentale 

1. • Testul 3D 

    

Caracterizarea comportamentului de înot al peștilor zebra se va realiza cu ajutorul sistemul Track 3D împreună cu aplicația software de observare EthoVisionXT 14, un produs al companiei NOLDUS din Olanda (Fig. 1). Acesta combină informațiile furnizate de către două camere poziționate ortogonal. Prima cameră oferă o vedere frontală (X,Y), iar cea de a doua cameră o vedere laterală (Y,Z) a peștilor care înoată în acvariul trapezoidal timp de 4 minute. În urma sincronizării celor două înregistrări, utilizând programul EthoVision XT 14, numeroși parametrii comportamentali precum distanța totală parcursă (mm), viteza de înot (mm/s) sau timpul petrecut în activitate și repaus (s) pot fi calculați. Mai mult traiectoriile 2D si 3D pentru fiecare pește pot fi reprezentate.

Fig. 1. Sistemul Track 3D împreună cu aplicația software de observare EthoVisionXT 14 utilizat pentru a urmări modificările comportamentale ale peștilor zebră în urma expunerii la compuși chimici

 

2. • Testul de interacțiune socială

    

Caracterizarea gradului de sociabilitate se va realiza cu ajutorul labirintului T adaptat protocolului de lucru împreună cu aplicația software de observare EthoVisionXT 11.5, un produs al companiei NOLDUS din Olanda (Fig. 2). Astfel, pentru determinarea comportamentului social, 2 pești din grupul de apartenență al individului analizat vor fi așezați într-o căsuță din brațul stâng al labirintului (căsuța va fi realizată prin amplasarea unei fante incolore). Timpul petrecut în brațul stâng, în apropierea celorlalți indivizi, va fi interpretat ca comportament social, iar timpul petrecut în brațul drept sau brațul central ca un comportament antisocial.

Fig. 2. Labirintul T adaptat pentru caracterizarea gradului de sociabilitate al peștelui zebră

3. Testul oglinzii

Caracterizarea nivelului de agresivitate se va realiza cu ajutorul labirintului T adaptat protocolului de lucru împreună cu aplicația software de observare EthoVisionXT 11.5, un produs al companiei NOLDUS din Olanda (Fig. 3). Astfel, pentru cuantificarea nivelului de agresivitate la nivelul brațului stâng se va așeza o oglindă. Timpul petrecut în brațul stâng, în fața oglinzii, va fi interpretat ca comportament agresiv.

 

 

Fig. 3. Labirintul T adaptat pentru caracterizarea gradului de agresivitate al peștelui zebră

Analize biochimice 

Pentru evaluarea nivelului stresului oxidativ din întregul corp al peștilor se va cuantifica activitatea a trei enzime: malondialdehidei (MDA), superoxid dismutazei (SOD) și glutation peroxidazei (GPx).

1. • Determinarea MDA

MDA va fi determinat ca marker de peroxidarea a lipidelor. Pe scurt, se amestecă 200 μL din fiecare probă cu acid tricloracetic (0.92 M în HCl 0.25 N) și acid tiobarbituric (26 mM). După agitare timp de 30 s, amestecul va fi introdus în baie de apă la 95º C timp de 30 min. După răcire la temperatura camerei, amestecul va fi centrifugat la 3000 rpm timp de 10 min. Absorbanța supernatantului va fi măsurată la 532 nm. O curbă standard va fi generată cu 1,1,3,3-tetrametoxipropanul (0.5 la 20 nmol mL^-1).

2. • Determinarea SOD

Pentru determinarea activității SOD și GPX vom folosi kiturilor certificate de la Merk (Germania), respectând specificațiile producătorului. Pentru cuantificarea activității AChE voi utiliza protocolul descris de Pan et al. (2020). Pe scurt, se amestecă 50 μL din fiecare probă de creier cu 50 μL iodură de acetilcolină (ATCh), iar după 15 minute la 30º C reacția va fi oprită cu 0.9 mL 5,5,-ditiobis(2-nitrobenzoic) (12.4 mg DNTB dizolvat în 125 mL 95% etanol, 75 mL apă ultrapură și 50 mL 0.1 M PBS, pH 7.5) și absorbanța va fi măsurată la 412 nm.

3. • Dozarea proteinelor

Pentru dozarea proteinelor voi folosi Metoda Bradford, care are la bază reacția de culoare dintre reactivul Bradford și proteine. Se amestecă 50 μL din fiecare probă cu 1.5 mL reactiv Bradford, iar după 30 minute la temperatura camerei se citește absorbanța la 595 nm. Cantitatea de proteină se calculează conform curbei de calibrare cu albumină din ser bovin (BSA).